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Agilent高效液相色譜儀-高效液相色譜儀操作步驟
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  Agilent高效液相色譜儀-高效液相色譜儀操作步驟的詳細資料:
 安捷倫高效液相色譜儀_高效液相色譜儀使用步驟
一、高效液相色譜儀使用步驟常規操作
  (1).過濾流動相,根據需要選擇不同的濾膜。
  (2).對抽濾后的流動相進行超聲脫氣10-20分鐘。
  (3).打開HPLC工作站(包括計算機軟件和色譜儀),連接好流動相管道,連接檢測系統。
  (4).進入HPLC控制界面主菜單,點擊manual,進入手動菜單。
  (5).有一段時間沒用,或者換了新的流動相,需要先沖洗泵和進樣閥。沖洗泵,直接在泵的出水口,用針頭抽取。沖洗進樣閥,需要在manual菜單下,先點擊purge,再點擊start,沖洗時速度不要超過10 ml/min。
  (6).調節流量,初次使用新的流動相,可以先試一下壓力,流速越大,壓力越大,一般不要超過2000。點擊injure,選用合適的流速,點擊on,走基線,觀察基線的情況。
  (7).設計走樣方法。點擊file,選取select users and methods,可以選取現有的各種走樣方法。若需建立一個新的方法,點擊new method。選取需要的配件,包括進樣閥,泵,檢測器等,根據需要而不同。選完后,點擊protocol。一個完整的走樣方法需要包括:a.進樣前的穩流,一般2-5分鐘;b.基線歸零;c.進樣閥的loading-inject轉換;d.走樣時間,隨不同的樣品而不同。
  (8).進樣和進樣后操作。選定走樣方法,點擊start。進樣,所有的樣品均需過濾。方法走完后,點擊postrun,可記錄數據和做標記等。全部樣品走完后,再用上面的方法走一段基線,洗掉剩余物。
  (9).關機時,先關計算機,再關液相色譜。
  (10).填寫登記本,由負責人簽字。
二、高效液相色譜儀使用步驟詳細操作
  1、開機設定參數(檢測波長、流速),更換所需流動相,檢查色譜柱是否正確。
  2、排液置換管路中流動相,沖洗進樣閥,洗好進樣針。
  3、沖洗色譜柱進行平衡,其間可提前進行樣品的處理,樣品信息的注冊。
  4、平衡好以后進空白試驗,排除系統污染。
  5、柱子穩定好以后進樣,等待運行結束(其間清洗進樣針),積分計算,出具報告。
  詳細操作步驟如下:
  1、開機操作:
 。1)、打開電源,用Harb相連接時,注意Harb電源,打開計算機,打開Bootp Server(一般啟動時已打開);
 。2)、自上而下打開個組件電源,Bootp Server里顯示有信號時(有六行字符),打開工作站(先打開On line);
 。3)、打開沖洗泵頭的10%異丙醇溶液的開關(需用針捅抽),控制流量大小,以能流出的最小流量為準;
 。4)、注意各流動相所剩溶液的容積設定,若設定的容積低于最低限會自動停泵,注意洗泵溶液的體積,及時加液;
 。5)、使用過程中要經常觀察儀器工作狀態,及時正確處理各種突發事件。
  2、先以所用流動相沖洗系統一定時間(如所用流動相為含鹽流動相,必須先用水沖洗20分鐘以上再換上含鹽流動相),正式進樣分析前30min左右開啟D燈或W燈,以延長燈的使用壽命;
  3、建立色譜操作方法,注意保存為自己命名的Method,勿覆蓋或刪除他人的方法及實驗結果;
  4、使用手動進樣器進樣時,在進樣前和進樣后都需用洗針液洗凈進樣針筒,洗針液一般選擇與樣品液一致的溶劑,進樣前必須用樣品液清洗進樣針筒3遍以上,并排除針筒中的氣泡;
  5、溶劑瓶中的沙芯過濾頭容易破碎,在更換流動相時注意保護,當發現過濾頭變臟或長菌時,不可用超聲洗滌,可用5%稀硝酸溶液浸泡后再洗滌;
  6、實驗結束后,一般先用水或低濃度甲醇水溶液沖洗整個管路30分鐘以上,再用甲醇沖洗。沖洗過程中關閉D燈、W燈;
  7、關機時,先關閉泵、檢測器等,再關閉工作站,然后關機,最后自下而上關閉色譜儀各組件,關閉洗泵溶液的開關;
  8、使用者須認真履行儀器使用登記制度,不要擅自拆卸儀器。
  流動相:
  1、流動相應選用色譜純試劑、高純水或雙蒸水,酸堿液及緩沖液需經過濾后使用,過濾時注意區分水系膜和油系膜的使用范圍;
  2、水相流動相需經常更換(一般不超過2天),防止長菌變質;
  3、使用雙泵時,A、B、C、D四相中,若所用流動相中有含鹽流動相,則A、D(進液口位于混合器下方)放置含鹽流動相,B、C(進液口位于混合器上方)放置不含鹽流動相;
  A、B、C、D四個儲液器中其中一個為棕色瓶,用于存放水相流動相。
  樣品:
  1、采用過濾或離心方法處理樣品,確保樣品中不含固體顆粒;
  2、用流動相或比流動相弱(若為反相柱,則極性比流動相大;若為正相柱,則極性比流動相。┑娜軇┲苽錁悠啡芤,盡量用流動相制備樣品液;
  手動進樣時,進樣量盡量小,使用定量管定量時,進樣體積應為定量管的3~5倍;
  色譜柱:
  1、使用前仔細閱讀色譜柱附帶的說明書,注意適用范圍,如pH值范圍、流動相類型等;
  2、使用符合要求的流動相;
  3、使用保護柱;
  4、如所用流動相為含鹽流動相,反相色譜柱使用后,先用水或低濃度甲醇水(如5%甲醇水溶液),再用甲醇沖洗。
  5、色譜柱在不使用時,應用甲醇沖洗,取下后緊密封閉兩端保存;
  6、不要高壓沖洗柱子;
  7、不要在高溫下長時間使用硅膠鍵合相色譜柱;
三、Waters 2695 型高效液相色譜儀操作方法
  1儀器組成及開機
  1.1儀器組成本儀器由Waters 2695分離單元、2996型二極管陣列檢測器、2420蒸發光散射檢測器、色譜管理工作站和打印機組成。
  2695分離單元包括四元梯度洗脫的溶劑輸送系統,四通道在線真空脫氣機(或氦氣脫氣機),可容納120個樣品瓶的自動進樣系統,柱溫箱,內置的柱塞桿密封墊清洗系統,溶劑瓶托盤,液晶顯示器,鍵盤用戶界面及軟盤驅動器。
  1.2開機依次接通2695分離單元、檢測器、計算機和打印機的電源。接通2695分離單元后,約20s儀器開始自檢,約1min后,顯示主屏幕,此時繼續各部件的初始化,待主屏幕上方標題區出現“Idle”時,儀器進入待命狀態。
  2溶劑管理系統的準備
  2.1流動相脫氣確認所有溶劑管路都充滿溶劑,按【Menu/Status】,進入“Status(1)”屏幕,光標選“Degasser”,按【Enter】,顯示選項屏幕,光標下移選“Continuous”,按【Enter】。
  2.2啟動溶劑管理系統
  2.2.1干啟動當溶劑的管路是干的或是需要更換溶劑時,在“Status(1)”屏幕下,按【Direct Function】,光標選“Dry Prime”,按【Enter】,顯示“Dry Prime”屏幕,按欲啟動的溶劑管路的屏幕鍵,如【OpenA】,光標選“Duration”,按數字鍵輸入5min,按【Continue】,待限定時間結束后,重復操作,使實驗所需的各溶劑管路均啟動、排氣并充滿流動相。
  2.2.2濕啟動在“Status(1)”屏幕下,光標選“Compomtion”中欲使用的流動相,輸入10 0%,按【Direct Function】,光標選“Wet Prime”,按【Enter】,顯示“Wet Prime”屏幕,輸入7.5Ml/min和6min,按【OK】,待限定時間結束后,對每種流動相重復操作。
  2.2.3平衡真空脫氣機在“Status(1)”屏幕下,光標選“Composition”,輸入流動相的組成,按【Enter】再用光標選“Degasser”中的“Normal”,按【Enter】,按【Direct Function】,光標選“Wet Prime”,輸入0.000mL/min和10min.,按【OK】。待限定時間結束后,按【Abort Prime】。
  3樣品管理系統的準備
  3.1沖洗自動進樣器在“Status(1)”屏幕下,光標選“Composition”,輸入流動相的組成。按【Direct Function】,光標選“PurgeInjector”,按【Enter】,顯示“Purge Injector”屏幕,輸入“Sample Loop Volumes 6.0”,光標下移“Compression Check”,按任意數字鍵,按【OK】。
  3.2沖洗進樣針在主屏幕下,按【Diag】,顯示“Diagnositcs”屏幕,按【Prime Ndl Wash】,顯示“Prime Needle Wash”屏幕,按【Start】,30s內應見溶劑從廢液排放口流出。按【Close】、【Exit】。
  3.3沖洗柱塞桿密封墊在主屏幕下,按【Diag】,顯示“Diagnosities”屏幕,按Prime Seal Wash,顯示“Prime Seal Wash”屏幕,按【Start】,待排放口有水流出,按【Halt】、【Close】、【Exit】。
  3.4裝入樣品與轉盤將樣品瓶插到樣品盤合適的位置,打開樣品倉門,顯示“Door is Open”屏幕,裝入樣品盤,按【Next】,直至所有樣品盤裝畢,關倉門。
  4編輯分析方法及執行樣品分析表
  在主屏幕下,按【Develop Methods】,顯示“Methods”屏幕。
  4.1編輯分析方法
  4.1.1建立新的分離方法在“Method”屏幕下,按【New】、【Separation Methods】,輸入方法名,按【Enter】,顯示分離方法屏幕,該屏幕共有6頁,通過按【Next】或【Prev】切換。如需設定梯度,在第(1)頁按【Gradient】,輸入后按【Exit】;如需設定色譜柱的溫度,在第(4)頁輸入后按【Exit】;在第(6)頁設定檢測器的種類,光標選“Absorbance Detector”,按【Enter】,光標選“48 6﹨2487”,按Abs(1)圖標,設定檢測波長,按【OK】、【Exit】、【Save】。
  4.1.2編輯已建立的分離方法在“Methods”屏幕下,光標選欲編輯﹨修改的分離方法的圖標,按【Edit】,編輯改各種分析參數,按【Exit】、【Save】。
  4.2編輯執行樣品分析表
  4.2.1建立新的樣品組在“Methods”屏幕下,按【New】、【Sample Set】,輸入樣品組名,按【Enter】,顯示方法組屏幕,在樣品組表中輸入待分析樣品的信息。在“Vial”中輸入樣品放置的位置;在“Function”中光標選擇“Sandard”或“Sample”;在“Method”中選擇已建立的方法;在“inj”中輸入進樣的次數;在“μL”中輸入進樣的體積;在“min”中輸入運行時間。按【Exit】、【Save】。
  4.2.2編輯已建立的樣品組在“Methods”屏幕下,光標選欲編輯﹨修改的方法組的圖標,按【Edit】,編輯﹨修改待分析樣品的信息,按【Exit】、【Save】。
  5運行樣品
  5.1在“Status(1)”屏幕下,光標選“Method”,按【Enter】,選已建立的分離方法;光標選“Flow”,輸入流速,光標選“Composition”,輸入流動相的組成。
  5.2在主屏幕下,按【Run Samples】,光標選已建立的樣品組,按【Run】、【Satrt】。
  6報告打印
  在主屏幕下,按【Config】,顯示“Configuration”屏幕,按【Reports】,在“Report Options”對話框中選擇欲輸出到打印機或軟盤的信息,按【OK】、【Exit】。
  7關機
  7.1使用完畢,按規定用適當的溶劑沖洗色譜柱、系統管路、自動進樣器、進樣針和柱塞桿密封墊,確保2695分離單元已徹底沖洗干凈后,關閉電源開關。
  7.2數據采集完畢后,關閉檢測器電源開關。
  7.3處理數據并打印報告后,關閉計算機和打印機電源開關,并做使用登記。
  附注:
 。1)2695分離單元除用上述的系統控制模式外,還可設置非交互模式和色譜工作
  站控制模式,詳見儀器使用說明書。
 。2)色譜管理工作站
 、倥渲冒惭b了數據處理軟件的計算機。
 、跀祿幚砣绻褂肳aters的Millennium色譜管理工作站控制2695分離單元分析測定樣品,當工作站采集數據時,2695分離單元屏幕上方的標題區出現“Remote”。色譜管理工作站的基本操作步驟為:設置一個含有2695分離單元的色譜系統,建立一個含有2695分離單元的儀器方法,用已獲得的儀器方法建立一個方法組,用已建立的方法組運行樣品,處理并打印出色譜運行所得到的數據
四、高效液相色譜儀注意事項
高效液相色譜法(HPLC)是目前應用廣泛的分離、分析、純化有機化合物(包括能通過化學反應轉變為有機化合物的無機物)的有效方法之一。 在已知的有機化合物中,約有80%能用高效液相色譜法分離、分析,而且由于此法條件溫和,不破壞樣品,因此特別適合高沸點、難氣化揮發、熱穩定性差的有機化合物和生命物質。
高效液相色譜儀是在經典液相柱色譜儀的基礎上,引入了氣相色譜儀的理論,采用了高壓輸液泵、高效固定相、梯度洗脫技術和高靈敏度檢測器,具有高壓、高速、高效、高靈敏度、高選擇性和應用范圍廣等特點。
高效液相色譜儀使用注意事項:
1、高效液相色譜的流動相應采用色譜純溶劑,以滿足儀器要求、避免損壞色譜柱;
2、嚴禁使用有污染的水等沖洗色譜柱,避免將互不相溶的溶劑一同進入泵內;
3、流動相需經過濾、除氣后方可使用;
4、待分析的樣品必須徹底溶解澄清、過濾,以避免堵塞、損壞色譜柱;
5、分析完成后,須注意及時清洗色譜柱和檢測器的比色池。
五、高效液相色譜柱標準操作程序(SOP)
為啥要學習使用高效液相色譜柱?
色譜柱的使用和保養:液相色譜儀由高壓液體泵、檢測器及液相色譜柱等三部分組成,其中液相色譜柱的正確安裝和使用,是液相色譜工作的關鍵;也是液相色譜工作者獲得正確可靠的實驗數據的必經之路,建立高效液相色譜柱日常維護與保養規程,保證能正常使用。
液相色譜柱的安裝
1、液相色譜柱的結構:
(1)液相色譜柱由柱管、壓帽、卡套(密封環)、篩板(濾片)、接頭、螺絲(封頭)與柱填料等組成。
柱管:多用不銹鋼制成,若果使用時柱壓不高于70kg/cm2時,也可采用厚壁玻璃或石英管,管內壁要求有很高的光潔度。用于柱填料的裝填?罩鹘M件均為不銹鋼材質,能耐受一般的溶劑作用。但由于含氯化物的溶劑對其有一定的腐蝕性,故使用時要注意,柱及連接管內不能長時間存留此類溶劑,以避免腐蝕。壓帽:即色譜柱兩端套合于柱管端外壁的塑性圓柱帽,中部有小孔,多為聚四氟乙烯制成,用于固定篩板。
密封環:位于接頭螺旋環內壁的彈性環,多為聚四氟乙烯制成,用于色譜柱兩端壓帽與柱外壁的密封。
(2)柱填料:
液相色譜柱的分離作用是在填料與流動相之間進行的,柱子的分類是依據填料類型而定。
正相柱:
多以硅膠為柱填料。根據外型可分為無定型和球型兩種,其顆粒直徑在3-10μm的范圍內。另一類正相填料是硅膠表面鍵合-CN,-NH2等官能團即所謂的鍵合相硅膠。
反相柱:
主要是以硅膠為基質,在其表面鍵合十八烷基官能團(ODS)的非極性填料。也有無定型和球型之分。
常用的其他的反相填料還有鍵合C8、C4、C2、苯基等,其顆粒粒徑在3-10μm之間。
2、色譜柱的安裝:
(1)拆開柱包裝盒,確認色譜柱的類型、尺寸、出廠日期以及柱內貯存的溶劑。
(2)擰下柱兩端接頭的密封堵頭放回包裝盒供備用。
(3)按柱管上標示的流動相流向,將色譜柱的入口端通過連接管與進樣閥出口相連接(如,條件允許,建議在柱前使用保護柱);柱的出口與檢測器連接。連接管是外徑為1.57 mm、內徑為0、1~0.3 mm的不銹鋼管。連接管的兩端均有空心螺釘及密封用壓環。在接管時一定要設法降低柱外死體積。連接管通過空心螺釘、壓環后盡量用力插到底,然后順時針擰緊空心螺釘,直到擰不動為止。
液相色譜柱的使用
色譜柱在使用前,進行柱的性能測試,并將結果保存起來,作為今后評價柱性能變化的參考。但要注意:柱性能可能由于所使用的樣品、流動相、柱溫等條件的差異而有所不同;另外,在做柱性能測試時是按照色譜柱出廠報告中的條件進行(出廠測試所使用的條件是更佳條件),只有這樣,測得的結果才有可比性。
1、樣品的前處理:
(1)使用流動相溶解樣品;
(2)使用予處理柱除去樣品中的強極性或與柱填料產生不可逆吸附的雜質;
(3)使用0.45μm的過濾膜過濾除去微粒雜質;
2、流動相的配制:
液相色譜是樣品組分在柱填料與流動相之間質量交換而達到分離的目的,因此,要求流動相具備以下的特點:
(1)流動相對樣品具有一定的溶解能力,保證樣品組分不會沉淀在柱中(或長時間保留在柱中)。
(2)流動相具有一定惰性,與樣品不產生化學反應(特殊情況除外)。
(3)流動相的黏度要盡量小,以便在使用較長的分析柱時能得到好的分離效果;同時,降低柱壓降,延長液體泵的使用壽命(可運用提高溫度的方法降低流動相的黏度)。
(4)流動相的物化性質要與使用的檢測器相適應,如使用UV檢測器,使用對紫外吸收較低的溶劑配制。
(5)流動相沸點不要太低,否則容易產生氣泡,導致實驗無法進行。
(6)在流動相配制好后,一定要進行脫氣。除去溶解在流動相中的微量氣體既有利于檢測,還可以防止流動相中的微量氧與樣品發生作用。
3、 流速的選擇:
因柱效是柱中流動相線性流速的函數,使用不同的流速可得到不同的柱效。對于一根特定的色譜柱,要追求更佳柱效,使用更佳流速。對內徑為4.6mm的色譜柱,流速一般選擇1mL/min,對于內徑為4.0mm柱,流速0.8mL/min為佳。當選用更佳流速時,分析時間可能延長?刹捎酶淖兞鲃酉嗟南礈鞆姸鹊姆椒ㄒ钥s短分析時間(如,使用反相柱時,可適當增加甲醇或乙腈的含量)。
4、 流動相使用注意事項:
(1)由于甲醇廉價,對于反相柱推薦使用甲醇體系(必須使用乙腈的場合除外)。
(2)對于正相柱推薦使用沸程為30-60℃的石油醚或提純后的己烷作流動相,沒有提純的己烷不得使用。用水使用超純水(電阻率大于18兆歐),去離子水及雙蒸水中含有酚類雜質,有可能影響分析結果。
(3)含水流動相在實驗前配制,尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動相不要過夜。加入xx,防止細菌生長。
(4)流動相要求使用0.45μm濾膜過濾,除去微粒雜質。
(5)使用HPLC級溶劑配制流動相,使用合適的流動相可延長色譜柱的使用壽命,提高柱性能。
液相色譜柱的保存
1、反向色譜柱實驗后的保養:
使用緩沖液或含鹽的流動相,實驗完后應用10%的甲醇/水沖洗30分鐘,洗掉色譜柱中的鹽,再用甲醇沖洗30分鐘。注意:不能用純水沖洗柱子,應該在水中加入10%的甲醇,防止將填料沖塌陷。
2、長期保存色譜柱:
如,色譜柱要長時間保存,必須存于合適的溶劑下,對于反相柱可以儲存于純甲醇或乙腈中,正相柱可以儲存于嚴格脫水后的純正己烷中,離子交換柱可以儲存于水(含防腐劑或硫柳汞)中,并將堵頭堵上,儲存溫度應該是室溫。
因為,色譜柱是消耗品,隨著使用時間或進樣次數的增加,會出現色譜峰高降低,峰寬加大或出現肩峰的現象,一般來說是柱效的下降。
1、反向柱的再生:
依次采用20~30倍的色譜柱體積的甲醇:水=10:90(V/V),乙腈,異丙醇作為流動相沖洗色譜柱,完成后再以相反順序沖洗色譜柱。
2、正相柱的再生:
依次以20~30倍的色譜柱體積正己烷、異丙醇(異丙醇粘度大,可降低流速,避免壓力過高)、二氯甲烷、甲醇作為流動相沖洗色譜柱,然后再以相反的順序沖洗色譜柱。要注意以上溶劑必須嚴格脫水。
3、離子交換柱的再生:
長時間在緩沖溶液中使用和進樣,將導致色譜柱離子交換能力下降。用稀酸緩沖溶液沖洗可以使陽離子柱再生,反之,用稀堿緩沖溶液沖洗可以使陰離子柱再生。
特別說明:
再生過程必須隨時關注柱壓變化,柱壓過高易導致硅膠變形與開裂及鍵合相極性端連接順序紊亂,同時要保證再生時間足夠。再生時選擇不具備在線脫氣的獨立泵送系統色譜儀器進行,以防正相溶劑損壞脫氣機密封膜或分子篩及比例閥等儀器精密部件。
液相色譜柱常見問題分析與解決方案
1、使用一段時間后柱壓過高:
解決方案:首先查看是否HPLC系統原因,排除系統原因后,原因基本是由于實驗過程中雜質在柱中的累積。盡量完善操作條件,做完樣品后要及時沖洗干凈,如緩沖鹽的流動相一定要用高比例的水溶液(如,90%)沖洗完全后再用有機相保存。
2、篩板堵塞與柱頭塌陷:
解決方法:如確定是色譜柱頭的過濾篩板被污染,可以將色譜柱反方向用甲醇沖洗至正常壓力,或者卸下色譜柱頭,小心取下篩板,用5%左右的硝酸溶液超聲處理20分鐘左右,再用純水超聲20分鐘左右,重新裝入色譜柱。
3、色譜柱頭的填料被樣品污染:
解決方法:
如確定色譜柱頭的填料被污染,將柱頭螺絲卸下,挖出柱內前段被污染的填料,用相同的柱填料重新填入,仔細修復后,重新安裝上柱頭螺絲。
4、色譜柱內緩沖液中的鹽遇到高濃度的甲醇或其他有機溶劑,形成結晶析出:
解決方法:
如確定是鹽結晶,用10%的甲醇/水沖洗色譜柱使柱內鹽全部溶解,再換高濃度甲醇。
注意事項:
1、無論何時,必須保證色譜柱柱床不干涸,尤其是進樣檢測和柱沖洗過程中不能讓流動相長時間(30min以上)走空,否則易使色譜柱干涸且帶入大量幾乎無法排出的氣泡,甚至導致柱床局部塌陷或中部開裂。
2、使用與保存時,嚴禁用力甩,絕對杜絕不小心猛烈撞擊或高處掉落,否則,易導致柱床機械性損壞,則再無再生可能。
3、當柱子和液相色譜儀聯結時,閥件或管路一定要清洗干凈;
4、避免使用高粘度的溶劑作為流動相;
5、進樣樣品要全溶解;
6、大多數反相色譜柱的pH穩定范圍是2~7.5,盡量不超過該色譜柱的pH范圍;
7、每天分析工作結束后,要清洗進樣閥中殘留的樣品;
8、每天分析測定結束后,都要用適當的溶劑來清洗柱;
9、若分析柱長期不使用,應用適當有機溶劑保存并封閉。

原創作者:杭州瑞析科技有限公司

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